Szczepionki

Szczepionki – informacje ogólne

Wakcynologia jest dziedziną nauki badającej szczepionki i ich wpływ na odporność indywidualną i populacyjną, a jej powstanie było możliwe dzięki postępowi w dziedzinie immunologii, biologii molekularnej i biotechnologii. W przypadku wielu chorób zakaźnych szczepionki są jedyną drogą do zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności ze względu na brak skutecznych leków. Opracowanie techniki wytwarzania szczepionek “od genu do antygenu” (ang. reverse vaccinology) możliwe było dzięki poznaniu genomów i proteomów drobnoustrojów. Technologia ta polega na komputerowej analizie genomu drobnoustroju i kodowanych przez niego białek, które mogą stanowić antygeny szczepionkowe. Schemat powstawania takiej szczepionki przedstawiono na rysunku 1.

Mechanizm działania szczepionek

Organizm nabywa odporność przeciw chorobom zakaźnym w wyniku procesów naturalnych lub wyniku interwencji medycznej – odporność sztucznie wytworzona. Oba typy odporności mogą zostać nabyte w sposób czynny poprzez zakażenie, szczepienie lub w sposób bierny np. poprzez podanie dożylne immunoglobulin. Niekiedy konieczne może być szybkie zabezpieczenie osoby wrażliwej na zakażenie i wówczas podaje się jednoczasowo immunoglobuliny i szczepionkę- tzw. uodpornienie czynno-bierne. Rodzaje odporności przeciwzakaźnej i sposób ich wytworzenia pokazuje rysunek 2.

Szczepienie uruchamia reakcję zbliżoną do naturalnego kontaktu z antygenem, która prowadzi do aktywacji limfocytów oraz powstania swoistych przeciwciał. Pierwszy kontakt organizmu z antygenem stymuluje pierwotną odpowiedź poszczepienną. Stężenie przeciwciał w tym okresie narasta powoli. Na początku pojawiają się przeciwciała klasy IgM, których stężenie narasta powoli a czas ich utrzymywania się w krwi wynosi 5-10 dni. Następnie w ich miejsce pojawiają się przeciwciała klasy IgG i IgA, które utrzymują się w organizmie dłużej i mają właściwości ochronne. Kolejny kontakt z danym antygenem powoduje szybką proliferację komórek wytwarzającym przeciwciała IgG o dużym powinowactwie do antygenu. Jest to tzw. wtórna odpowiedź poszczepienna. Efekt ochronny szczepień wynika z pobudzenia odporności komórkowej i powstawania limfocytów B pamięci, które podczas ponownego kontaktu z drobnoustrojem zapewniają szybką indukcję syntezy przeciwciał. Skuteczność immunologiczna szczepionki określana jest poprzez następujące parametry: stężenie swoistych przeciwciał poszczepiennych klasy IgG i ich cechy jakościowe m. in. przynależność do podklasy, powinowactwo, awidność (siłą wiązania antygenu). Niezbędne jest wyznaczenie zabezpieczającego poziomu przeciwciał IgG. Jest to najmniejsze stężenie chroniące osobę zaszczepioną przed kolejnym zachorowaniem po kontakcie z drobnoustrojem w zwykłych warunkach i jest wyznaczane na podstawie badań eksperymentalnych i klinicznych. Niestety stężenie przeciwciał wytworzone po zakończeniu szczepień zmniejsza się w upływem czasu, jeśli nie następuje ponowny kontakt z antygenem w warunkach normalnych lub po podaniu dawki przypominającej szczepionki. Choroba u osoby zaszczepionej może wynikać ze zmniejszenia stężenia przeciwciał poniżej poziomu zabezpieczającego lub ze znacznej dawki zarażającej drobnoustroju.

Rodzaje szczepionek i przykłady

Szczepionka jest lekiem pochodzenia biologicznego zawierającym substancje zdolne do indukcji procesów immunologicznych bez wywoływania choroby. Można ją podać pozajelitowo (domięśniowo, podskórnie lub śródskórnie), dojelitowo (doustnie) lub na śluzówkę (donosowo). Szczepionki dzieli się ze względu na zdolność pobudzenia specyficznych mechanizmów odporności na swoiste, które stymulują trwałą odporność przeciw konkretnej chorobie zakaźnej oraz nieswoiste, które modulują odporność nieswoistą. W szczepionkach swoistych znajdują się antygeny, które stymulują mechanizmy istotne dla początkowych etapów odpowiedzi na zakażenie lub neutralizujące główne czynniki zjadliwości drobnoustroju. Z kolei w nieswoistych znajdują się inaktywowane, tj. pozbawione aktywności, drobnoustroje, których antygeny pobudzają nieswoistą odporność komórkową i humoralną, głównie w zakresie aktywacji limfocytów cytotoksycznych i wytwarzania interferonu.

W procesie wytwarzania szczepionki swoistej zmienia się właściwości drobnoustroju lub jego produktów, tak by nie były one chorobotwórcze ale miały zachowaną zdolność do wywoływania swoistej reakcji immunologicznej. Atenuacja to proces modyfikacji właściwości chorobotwórczych żywego drobnoustroju w celu wytworzenia szczepionki, natomiast inaktywacja to proces zabicia drobnoustroju. W zależności od rodzaju antygenu można wyróżnić 4 typy szczepionek:  

• zawierające żywe organizmy (pochodzenia naturalnego i sztucznie otrzymane),
• zawierające pełne komórki zabitych drobnoustrojów (wirusowe, bakteryjne),
• zawierające antygeny powierzchniowe drobnoustrojów (np. polisacharydy otoczkowe, antygen powierzchniowy),
• zawierające inaktywowane toksyny- toksoid.

Można wyróżnić szczepionki mono- i poliwalentne, zawierające odpowiednio jeden gatunek/serotyp drobnoustroju lub wiele serotypów tego samego drobnoustroju. Możliwe jest również połączenie szczepionek przeciw różnych chorobom w jednym preparacie otrzymując tzw. szczepionkę skojarzoną. Przykłady szczepionek przedstawiono w tabeli 1.

Choroba	Typ antygenu użyty do produkcji szczepionki- rodzaj szczepionki	Droga podania	Indukowany mechanizm immunologiczny
Odra	żywy- atenuowany wirus ludzki	podskórna lub domięśniowa	surowicze IgG, limfocyty T
WZW typu B	martwy- rekombinowany antygen HBs uzyskiwany w hodowli komórek drożdży	podskórna lub domięśniowa	surowicze IgG
Dur brzuszny	żywy- inaktywowane bakterie	podskórna	surowicze IgG
Gruźlica	żywy- atenuowane prątki bydlęce	podskórna lub śródskórna	limfocyty T
Grypa	martwy- podjednostkowa lub rozszczepiony wirion szczepów ludzkich;żywa- zmutowany szczep ludzki	domięśniowa, śródskórna lub domięśniowa; donosowa	surowicze IgG, śluzówkowe IgA, limfocyty T
Tężec	martwy- toksoid	domięśniowa	surowicze IgG

Inne rodzaje szczepionek:

• szczepionki skojarzone – jest coraz więcej szczepionek tego typu. Nowe połączenia antygenów wymagają dokładnego dopasowania poszczególnych składników i adiuwantów. Korzyścią jednoczasowego podania kilku antygenów jest m. in. zmniejszenie ilości wkłuć, a także redukcja zawartości substancji dodatkowych i poprawa terminowości realizacji szczepień. Przykładem jest szczepionka skojarzona przeciwko błonicy, tężcowi i krztuścowi (DTP),
• szczepionka DNA – zawiera oczyszczony DNA z układem promotora i podczas podawania domięśniowego powoduje silną odpowiedź zarówno komórkową jak i humoralną, bez wytworzenia tolerancji. Gen kodujący konkretne białko drobnoustroju umieszcza się w plazmidzie, który po podaniu wędruje do jądra komórkowego, gdzie dochodzi do jego transkrypcji. Kodowane przez niego białka są wytwarzane w komórce i następnie wychwytywane przez komórki prezentujące antygen. Dodanie układu promotora do genu pozwala uzyskać w komórce ludzkiej ekspresję genu zawartego w plazmidzie. Postęp w dziedzinie szczepionek DNA można śledzić na stronie: http://www.violinet.org/dnavaxdb/. Więcej informacji: https://www.who.int/biologicals/areas/vaccines/dna/en/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6274812/,
• szczepionka wektorowa – wektor szczepionkowy to atenuowany, czyli zmodyfikowany drobnoustrój, do którego genomu wprowadzono gen innego drobnoustroju. Po wprowadzeniu do organizmu ludzkiego wektor ulega namnożeniu i możliwe jest zaprezentowanie limfocytom białka kodowanego przez dodany gen. jako wektor mogą służyć np. wirusy z rodziny Herpes, Picorna, bakterie- prątek gruźlicy (BCG). Z wprowadzaniem żywych wektorów związane jest jednak pewne ryzyko ich potencjalnej zjadliwości i immunogenności,
• szczepionka antyidiotypowa- szczepionki te wykorzystują przeciwciała antyidiotypowe, czyli skierowane przeciwko determinantom antygenowym innych przeciwciał. Przeciwciała rozpoznające immunogenne determinanty antygenowe drobnoustrojów są pobierane i izolowane z surowicy ozdrowieńców i następnie podawane zwierzętom w celu wytworzenia przez nie przeciwciał antyidiotypowych. Dzięki temu nowowytworzone przeciwciała mają paratop (tj. fragment przeciwciała wiążący antygen) przypominający determinantę antygenową drobnoustroju i przez to zastępują naturalny antygen, co prowadzi do indukcji odpowiedzi immunologicznej,
• szczepionka nieswoista – jest mieszaniną zabitych drobnoustrojów. Stosowane są w celu niespecyficznej stymulacji odporności w przypadku nawracających lub przewlekłych zakażeń o różnej etiologii. 

Wytwarzanie szczepionek ^[2][3]

Szczepionki mają bardzo rygorystyczne wymagania dotyczące wytwarzania, monitorowania i zgodności z wymogami. Bezpieczne i konsekwentne wytwarzanie szczepionek bazuje m. in. na zdefiniowaniu sposobu produkcji, testowaniu produktu i regulacjach autoryzacyjnych do wypuszczenia na rynek i dystrybucji. W Unii Europejskiej organem regulującym wszelkie kwestie związane z produktami leczniczymi jest European Medicines Agency (EMA), jej odpowiednikiem w Stanach Zjednoczonych jest Food and Drug Administration (FDA). Szczepionki są rejestrowane z zastosowaniem centralnej procedury, która powoduje, że szczepionka zarejestrowana w danym kraju, jest jednocześnie licencjonowana w każdym kraju UE. Wytwarzanie szczepionek dla ludzi jest regulowane m. in. standardami “Dobra praktyka produkcyjna” (DPP, ang. Good Manufacturing Practises– GMP). 

Wytwarzanie szczepionek składa się z kilku etapów. Pierwszym krokiem jest wytworzenie antygenu, który wywołuje odpowiedź immunologiczną. Można to zrobić poprzez wytwarzanie patogenu w celu późniejszej inaktywacji lub wyizolowania podjednostki patogenu, a także wytwarzanie zrekombinowanych białek pochodzących z patogenu. Wirusy namnaża się w pierwotnej hodowli komórkowej, gdzie są uważnie kontrolowane, przechowywane i charakteryzowane. Patogeny bakteryjne hodowane są w bioreaktorach z podłożem zapewniającym optymalną wydajność antygenu przy zachowaniu jego integralności. Białka rekombinowane mogą być produkowane w bakteriach, komórkach drożdży i hodowlach komórkowych. Na początku niezbędne jest ustalenie głównej populacji komórek tzw. bank główny komórek. Jest to kolekcja komórek znajdujących się w fiolkach, które tworzą materiał wyjściowy dla wszystkich przyszłych produkcji. Dzięki znacznej wydajności i braku czynników przypadkowych są dobrym materiałem dla “produkcyjnych” banków komórek wykorzystywanych jako rutynowa hodowla do partii produkcyjnych. Ostateczna szczepionka jest bezpośrednim złożeniem materiałów wyjściowych a zmiana w jej składzie jest złożona.  Następnym krokiem jest wyizolowanie antygenu z substratu i oddzielenie go od środowiska wzrostowego. Może to być izolacja  z pożywki wolnego wirusa, wydzielanych z komórek białek lub komórek z obecnym wewnątrz antygenem. Kolejnym krokiem jest oczyszczenie antygenu. W przypadku szczepionek, które zawierają rekombinowane białko, etap ten polega na czyszczeniu z wykorzystaniem wielu chromatografii kolumnowych. W przypadku inaktywowanej szczepionki wirusowej wystarcza inaktywacja wirusa. Nie ma konieczności dalszego oczyszczania. Formuła szczepionki ma na celu maksymalizację nasycenia szczepionki, przy jednoczesnym dostarczeniu jej w formie umożliwiającej wydajną dystrybucję. Wytworzona szczepionka może zawierać substancje pomocnicze w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, stabilizatory przedłużające okres przydatności użycia, a także środki konserwujące pozwalające na dostarczanie fiolek wielodawkowych. Kolejnym etapem jest formowanie, które polega na połączeniu wszystkich składników stanowiących ostateczną szczepionkę i równomiernym wymieszaniu ich. Wszystkie czynności są przeprowadzane w ściśle kontrolowanych warunkach, pracownicy noszą specjalną odzież ochronną, aby uniknąć zanieczyszczenia przypadkowymi substancjami. Monitorowanie środowiska i powierzchni krytycznych jest przeprowadzana podczas w.w. operacji. Testy kontroli jakość (QC- ang. Quality Control) na tym etapie zwykle składają się z sprawdzenia bezpieczeństwa, siły działania, czystości, sterylności i innych testów specyficznych dla produktu. W tej fazie pojemniki napełniane są szczepionką i zamykane sterylnymi zatyczkami. Pojemniki są uprzednio skrupulatnie oczyszczone, pozbawione zanieczyszczeń. Jeśli szczepionka ma być liofilizowana, tj. poddana sublimacyjnemu suszeniu zamrożonych substancji, korki fiolki wkłada się tylko częściowo by umożliwić ulatnianie się wilgoci. W komorze liofilizacyjne wszystkie fiolki otrzymują korki zewnętrzne w celu zapewnienia integralności zamknięcia pojemnika. Aby wykluczyć zewnętrzne zanieczyszczenie wszystkie operacje podczas napełniania muszą odbywać się w ściśle kontrolowanym środowisku, w którym ludzie, sprzęt i komponenty są wprowadzane do krytycznego obszaru w sposób kontrolowany. Po napełnieniu wszystkie pojemniki są sprawdzane z użyciem półautomatycznego lub automatycznego sprzętu przeznaczonego do wykrywania drobnych defektów kosmetycznych i fizycznych. Również w tym miejscu przeprowadzana jest rozległa kontrola i monitorowanie środowiska i krytycznych powierzchni, a także przeprowadzane są testy jakości (QC).

Niewłaściwe warunki dystrybucji i przechowywania mogą niekorzystnie wpłynąć na skuteczność szczepionki. Wrażliwość szczepionki na niekorzystne warunki środowiska jak np. wysokie temperatury jest zależna od jej składu. Żywe atenuowane szczepionki są zazwyczaj bardziej podatne niż toksoidy, tj. szczepionki zawierające inaktywowane toksyny i szczepionki inaktywowane. 

Choroba	Nazwa handlowa	Nazwa generyczna	Hodowla komórkowa/ fermentacja	Izolacja	Oczyszczanie	Formulacja	Konserwant
Grypa Influenza	Fluzone	Inactivated Influenza Virus Vaccine	zarodki jaj kurzych	Wolne wirowanie i filtracja	Oczyszczani / stężenie na liniowym gradiencie gęstości sacharozy przy użyciu ciągłego wirowania, a następnie dodatkowego oczyszczania metodami chemicznymi,	Sól fizjologiczna buforowana fosforanem z żelatyną jako stabilizatorem	Tiomersal (w niektórych opakowaniach)

Dopuszczenie szczepionek do użytku

Szczepionki jak również inne leki muszą przejść przez kilka etapów:

• etap badań przedklinicznych, zwieńczeniem których jest podanie opracowanej substancji zwierzętom, np. myszom, w celu obserwacji odpowiedzi immunologicznej organizmu na lek,
• pierwsza faza – lek/szczepionka jest podawana małej grupie ochotników, w celu określenia bezpieczeństwa i dawki substancji oraz potwierdzenia jej zdolności do immunizacji organizmu człowieka,
• druga faza – lek/szczepionka jest podawana kilkuset osobom podzielonym na grupy w celu obserwacji ewentualnych różnic w poszczególnych grupach wiekowych. Sprawdzane jest tu również bezpieczeństwo i zdolność stymulacji odpowiedzi układu odpornościowego,
• trzecia faza – lek/szczepionka podawana jest tysiącom ludzi, podzielonym na dwie grupy, z których jedna dostaje nową substancję, a druga placebo. W przypadku szczepionki sprawdza się ilość zainfekowanych w obu grupach. Faza ta pozwala określić czy szczepionka rzeczywiście zapobiega infekcji drobnoustrojem,
• dopuszczenie – regulacje prawne zależą od państwa, w którym prowadzone są badania. Jeśli lek/szczepionka pozytywnie przeszła poprzednie fazy, może zostać dopuszczona do użytku. W czasie pandemii, dopuszczenie szczepionki może się odbywać na “awaryjnych” warunkach,
• czwarta faza – obejmuje monitorowanie bezpieczeństwa, skuteczności po dopuszczeniu do stosowania leku/szczepionki na szeroką skalę. Wszelkie działania niepożądane (tzw. NOP- niepożądane odczyn poszczepienny) muszą być zgłaszane do odpowiedniego organu.

Szczepionki COVID-19

Obecnie w toku badań jest ponad 160 szczepionek na koronawirusa, w tym 26 w klinicznej fazie badań i 139 w przedklinicznej (stan na 31.07.2020 wg. raportu WHO „DRAFT landscape of COVID-19 candidate vaccines- 31 July 2020”).  Dane te dynamicznie się zmieniają. Postępy badań nad szczepionkami można śledzić na stronie WHO.

 Cele szczepień

Podstawowym celem szczepionki jest uodpornienie człowieka na konkretny patogen poprzez wprowadzenie nieaktywnej wersji tego patogenu lub jego części do organizmu człowieka i stymulowanie specyficznych mechanizmów odporności  w celu  pozyskania możliwie długiej pamięci immunologicznej. Dzięki temu reakcja organizmu będzie szybsza i silniejsza podczas kolejnego “spotkania” z danym antygenem.

Wymagania stawiane szczepieniom są wysokie i obejmują:

• maksymalne bezpieczeństwo i skuteczność (możliwy opis dotyczący bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek),
• powszechna dostępność, 
• trwałość,
• prosty sposób podania,
• niska cena.

Z tych względów wprowadzenie nowej szczepionki na rynek trwa wiele lat. Ponieważ każdy organizm jest inny to aczkolwiek prawdopodobieństwo jest bardzo małe, mogą pojawić się efekty uboczne. Każdy niepożądany odczyn poszczepienny (NOP) musi być zgłoszony do odpowiednich organów.

Każda szczepionka opatrzona jest na ogół listą kilku przeciwwskazań dotyczących jej stosowania, np. wynikających z obniżonej odporności biorcy.

Bibliografia:

[1] Gołąb, J., Jakóbisiak, M., Lasek, W., & Stokłosa, T. (2017). Immunologia. Wydawnictwo naukowe PWN.

[2] Stanley A. Plotkin, Walter Orenstein, Paul A. Offit, Kathryn M. Edwards. (2018). Plotkin’s vaccines.

[3] https://pubmedinfo.org/2017/08/20/technologie-wytwarzania-szczepionek/