ELISA

Z BioInf

Spis treści

Test ELISA

Z ang. Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, czyli test immunoenzymatyczny. Szeroko rozpowszechniona metoda diagnostyczna i badawcza opisana w latach 60 XX-wieku oparta na wykorzystaniu enzymów do wykrywania reakcji antygenów ze swoistymi przeciwciałami. Pierwotnie test ELISA wykorzystywano do wykrywania obecności przeciwciał w surowicy. Obecnie test ma zastosowanie nie tylko do oznaczeń jakościowych ale także ilościowych. Standardowo testy ELISA wykonuje się na 96-dołowych płytkach. Studzienki płytki opłaszcza się odpowiednim przeciwciałem lub antygenem. Następnie, aby zapobiec niespecyficznym wiązaniom białek, wykorzystuje się albuminę lub odtłuszczone mleko. Reakcję antygen-przeciwciało uwidacznia się wykorzystując reakcję barwną, dzięki zastosowaniu enzymu: fosfatazy alkalicznej (przekształca bezbarwny fosforan n-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol) lub peroksydazy chrzanowej (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny) lub oksydazy glukozowej (z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny). Zmianę intensywności barwy mierzy się spektrofotometrycznie a wyniki kalibruje względem prób kontrolnych tworząc krzywą standardową, pozwalająca na określenie ilości produktu reakcji.

Rodzaje testów ELISA

Test bezpośredni

1. test bezpośredni – podłoże płytek titracyjnych opłaszczone jest antygenem. Po inkubacji z roztworem zawierającym skoniugowane z enzymem specyficzne przeciwciało, do mieszaniny dodaje się substrat, który dzięki aktywności enzymu daje barwny produkt. Intensywność zabarwienia koreluje z ilością koniugatów antygen-przeciwciało. Schematyczna ilustracja testu bezpośredniego ELISA jest przedstawiona na rysunku 1.

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja bezpośredniego testu ELISA (źródło: http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/).

Test pośredni ELISA

2. test pośredni ELISA – opłaszczoną antygenem płytkę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie kompleksy antygen-przeciwciało wykrywa się przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszprzędowemu. Ten typ ELISA jest najczęściej wykorzystywany, gdyż nie wymaga znakowania przeciwciała pierwszorzędowego, które jest drogie. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 2.

Rysunek 2. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA (źródło: http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/).

Test podwójnego wiązania ELISA (kanpakowy)

3. test podwójnego wiązania ELISA (kanpakowy) – płytkę titracyjną opłaszcza się przeciwciałami specyficznymi dla badanego białka. Następnie przeprowadza się inkubację z antygenem a potem roztworem swoistego przeciwciała. Oba zastosowane przeciwciała wykazują powinowactwo do innej domeny białka, stąd wraz z antygenem tworzą charakterystyczną „kanapkowe” warstwy. Utworzone kompleksy uwidacznia się poprzez zastosowanie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem. W teście kanapkowym można zastosować również wyznakowane przeciwciała pierwszorzędowe. Ten typ testu ELISA pozwala na oznaczenie stężenia określonego białka w roztworze, gdyż pozostałe białka są wypłukiwane a na płytce związane pozostaje tylko badane białko z myślą o którym opłaszczono płytkę. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 3.

Rysunek 3. Schematyczna ilustracja kanapkowego testu ELISA (źródło: http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/).

Test kompetycyjny ELISA

4. test kompetycyjny ELISA – w teście tym wykorzystuje się konkurencję różnych przeciwciał w mieszaninie o miejsce wiązania z antygenem zimmobilizowanym na płytce. Do opłaszczonych białek fazy stałej dodaje się testowaną surowicę oraz immunoglobuliny. Intensywność uzyskanej reakcji barwnej jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia przeciwciał zawartych w surowicy.

Piśmiennictwo:

  1. http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/
  2. http://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100
Osobiste