(Utworzył nową stronę „==Test ELISA== Z ang. Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, czyli test immunoenzymatyczny. Szeroko rozpowszechniona metoda diagnostyczna i badawcza opisana w latach 6...”) |
(→Rodzaje testów ELISA) |
||
(Nie pokazano 2 pośrednich wersji utworzonych przez tego samego użytkownika) | |||
Linia 3: | Linia 3: | ||
==Rodzaje testów ELISA== | ==Rodzaje testów ELISA== | ||
− | === | + | ===Test bezpośredni=== |
1. test bezpośredni – podłoże płytek titracyjnych opłaszczone jest antygenem. Po inkubacji z roztworem zawierającym skoniugowane z enzymem specyficzne przeciwciało, do mieszaniny dodaje się substrat, który dzięki aktywności enzymu daje barwny produkt. Intensywność zabarwienia koreluje z ilością koniugatów antygen-przeciwciało. Schematyczna ilustracja testu bezpośredniego ELISA jest przedstawiona na rysunku 1. | 1. test bezpośredni – podłoże płytek titracyjnych opłaszczone jest antygenem. Po inkubacji z roztworem zawierającym skoniugowane z enzymem specyficzne przeciwciało, do mieszaniny dodaje się substrat, który dzięki aktywności enzymu daje barwny produkt. Intensywność zabarwienia koreluje z ilością koniugatów antygen-przeciwciało. Schematyczna ilustracja testu bezpośredniego ELISA jest przedstawiona na rysunku 1. | ||
+ | [[Image:elisa1.jpg|thumb|center|800px| Rysunek 1. Schematyczna ilustracja bezpośredniego testu ELISA (źródło: http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/).]] | ||
− | + | ===Test pośredni ELISA=== | |
− | === | ||
2. test pośredni ELISA – opłaszczoną antygenem płytkę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie kompleksy antygen-przeciwciało wykrywa się przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszprzędowemu. Ten typ ELISA jest najczęściej wykorzystywany, gdyż nie wymaga znakowania przeciwciała pierwszorzędowego, które jest drogie. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 2. | 2. test pośredni ELISA – opłaszczoną antygenem płytkę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie kompleksy antygen-przeciwciało wykrywa się przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszprzędowemu. Ten typ ELISA jest najczęściej wykorzystywany, gdyż nie wymaga znakowania przeciwciała pierwszorzędowego, które jest drogie. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 2. | ||
+ | [[Image:elisa2.jpg|thumb|center|800px| Rysunek 2. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA (źródło: http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/).]] | ||
+ | ===Test podwójnego wiązania ELISA (kanpakowy)=== | ||
+ | 3. test podwójnego wiązania ELISA (kanpakowy) – płytkę titracyjną opłaszcza się przeciwciałami specyficznymi dla badanego białka. Następnie przeprowadza się inkubację z antygenem a potem roztworem swoistego przeciwciała. Oba zastosowane przeciwciała wykazują powinowactwo do innej domeny białka, stąd wraz z antygenem tworzą charakterystyczną „kanapkowe” warstwy. Utworzone kompleksy uwidacznia się poprzez zastosowanie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem. W teście kanapkowym można zastosować również wyznakowane przeciwciała pierwszorzędowe. Ten typ testu ELISA pozwala na oznaczenie stężenia określonego białka w roztworze, gdyż pozostałe białka są wypłukiwane a na płytce związane pozostaje tylko badane białko z myślą o którym opłaszczono płytkę. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 3. | ||
− | + | [[Image:elisa3.jpg|thumb|center|800px| Rysunek 3. Schematyczna ilustracja kanapkowego testu ELISA (źródło: http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/).]] | |
− | 3. | ||
− | === | + | ===Test kompetycyjny ELISA=== |
− | 4. test kompetycyjny ELISA – w teście tym wykorzystuje się konkurencję różnych przeciwciał w mieszaninie o miejsce wiązania z antygenem zimmobilizowanym na płytce. Do opłaszczonych białek fazy stałej dodaje się testowaną surowicę oraz immunoglobuliny. Intensywność uzyskanej reakcji barwnej jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia przeciwciał zawartych w surowicy. | + | 4. test kompetycyjny ELISA – w teście tym wykorzystuje się konkurencję różnych przeciwciał w mieszaninie o miejsce wiązania z antygenem zimmobilizowanym na płytce. Do opłaszczonych białek fazy stałej dodaje się testowaną surowicę oraz immunoglobuliny. Intensywność uzyskanej reakcji barwnej jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia przeciwciał zawartych w surowicy. |
==Piśmiennictwo:== | ==Piśmiennictwo:== | ||
# http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/ | # http://www.rajaha.com/elisa-test-what-principle-types/ | ||
# http://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100 | # http://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100 |
Aktualna wersja na dzień 14:55, 14 mar 2013
Spis treści
Test ELISA
Z ang. Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, czyli test immunoenzymatyczny. Szeroko rozpowszechniona metoda diagnostyczna i badawcza opisana w latach 60 XX-wieku oparta na wykorzystaniu enzymów do wykrywania reakcji antygenów ze swoistymi przeciwciałami. Pierwotnie test ELISA wykorzystywano do wykrywania obecności przeciwciał w surowicy. Obecnie test ma zastosowanie nie tylko do oznaczeń jakościowych ale także ilościowych. Standardowo testy ELISA wykonuje się na 96-dołowych płytkach. Studzienki płytki opłaszcza się odpowiednim przeciwciałem lub antygenem. Następnie, aby zapobiec niespecyficznym wiązaniom białek, wykorzystuje się albuminę lub odtłuszczone mleko. Reakcję antygen-przeciwciało uwidacznia się wykorzystując reakcję barwną, dzięki zastosowaniu enzymu: fosfatazy alkalicznej (przekształca bezbarwny fosforan n-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol) lub peroksydazy chrzanowej (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny) lub oksydazy glukozowej (z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny). Zmianę intensywności barwy mierzy się spektrofotometrycznie a wyniki kalibruje względem prób kontrolnych tworząc krzywą standardową, pozwalająca na określenie ilości produktu reakcji.
Rodzaje testów ELISA
Test bezpośredni
1. test bezpośredni – podłoże płytek titracyjnych opłaszczone jest antygenem. Po inkubacji z roztworem zawierającym skoniugowane z enzymem specyficzne przeciwciało, do mieszaniny dodaje się substrat, który dzięki aktywności enzymu daje barwny produkt. Intensywność zabarwienia koreluje z ilością koniugatów antygen-przeciwciało. Schematyczna ilustracja testu bezpośredniego ELISA jest przedstawiona na rysunku 1.
![](/mediawiki/images/d/d5/Elisa1.jpg)
Test pośredni ELISA
2. test pośredni ELISA – opłaszczoną antygenem płytkę inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie kompleksy antygen-przeciwciało wykrywa się przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszprzędowemu. Ten typ ELISA jest najczęściej wykorzystywany, gdyż nie wymaga znakowania przeciwciała pierwszorzędowego, które jest drogie. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 2.
![](/mediawiki/images/1/15/Elisa2.jpg)
Test podwójnego wiązania ELISA (kanpakowy)
3. test podwójnego wiązania ELISA (kanpakowy) – płytkę titracyjną opłaszcza się przeciwciałami specyficznymi dla badanego białka. Następnie przeprowadza się inkubację z antygenem a potem roztworem swoistego przeciwciała. Oba zastosowane przeciwciała wykazują powinowactwo do innej domeny białka, stąd wraz z antygenem tworzą charakterystyczną „kanapkowe” warstwy. Utworzone kompleksy uwidacznia się poprzez zastosowanie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem. W teście kanapkowym można zastosować również wyznakowane przeciwciała pierwszorzędowe. Ten typ testu ELISA pozwala na oznaczenie stężenia określonego białka w roztworze, gdyż pozostałe białka są wypłukiwane a na płytce związane pozostaje tylko badane białko z myślą o którym opłaszczono płytkę. Schematyczna ilustracja pośredniego testu ELISA jest zilustrowana na rysunku 3.
![](/mediawiki/images/7/73/Elisa3.jpg)
Test kompetycyjny ELISA
4. test kompetycyjny ELISA – w teście tym wykorzystuje się konkurencję różnych przeciwciał w mieszaninie o miejsce wiązania z antygenem zimmobilizowanym na płytce. Do opłaszczonych białek fazy stałej dodaje się testowaną surowicę oraz immunoglobuliny. Intensywność uzyskanej reakcji barwnej jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia przeciwciał zawartych w surowicy.