TUNEL

Z BioInf

TUNEL

Metoda biologii molekularnej pozwalająca na detekcję komórek apoptotycznych oparta o detekcję fragmentacji DNA. Istotną cechą apoptotycznych komórek jest bowiem fragmentacja DNA na odcinki równe wielokrotności długości nukleosomów. Różnice w sposobie degradacji DNA stanowią podstawę zróżnicowania śmierci nekrotycznej od apoptotyczne komórek. W przypadku fragmentacji nekrotycznej, następuje przypadkowa degradacja materiału genetycznego, który na żelu agarozowym tworzy charakterystyczną smugę (smear). W przypadku apoptozy obserwuje się natomiast fragmentację DNA odzwierciedlającą strukturę oktamerów histonowych, w wyniku czego na żelu agarozowym powstaje charakterystyczna drabinka fragmentów DNA.

Podczas apoptozy na skutek trawienia DNA powstaje wiele pęknięć jedno- lub dwuniciowych. Ich znakowanie jest podstawą techniki TUNEL (z ang. Terminal Deoksynukleotydyl Transferase Mediated d-UTP Nick End-Labeling). W metodzie tej terminalna transferaza (TdT) dobudowuje znakowane digoksygeniną nukleotydy bez obecności matrycy do wolnych końców wodorotlenkowych.

W przypadku analizy histochemicznej metodą TUNEL, związane dogoksyna-dUTP wykrywa się poprzez zastosowanie peroksydazy chrzanowej, a następnie podaniu substratu reakcji DAB. W wyniku reakcji w preparacie uzyskuje się brązową barwę jąder komórkowych. Jądrą nieapoptotyczne wybarwia się hematoksyliną. Przykładowy wynik analizy histochemicznej metodą TUNEL przedstawia rysunek 2.

Rysunek 2. Przykład analizy metodą TUNEL. Brązowe jądra komórkowe reprezentują komórki apoptotyczne. Jądra błękitne są widoczne w komórkach żywych (źródło: http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0006899307019555-gr3.jpg).

Piśmiennictwo:

  1. http://www.pfb.info.pl/files/kwartalnik/1_2005/Warzych-Lechniak.pdf
  2. http://www.nowinylekarskie.ump.edu.pl/uploads/2008/3/223_3_77_2008.pdf
  3. http://www.ihcworld.com/_protocols/apoptosis/tunel_enzyme.htm
Osobiste