PCR - analiza produktu PCR (ASA, ASO, RFLP)

Z BioInf

PCR - analiza produktu PCR (ASA, ASO, RFLP)

ASA (ang. allele-specific amplification) - amplifikacja specyficzna względem allelu, gdzie przynajmniej jeden ze starterów pochodzi z sekwencji polimorficznej, gdzie można znaleźć mutację (przy 3’ końcu?). W metodzie tej wykorzystuje się zwykle 3 startery: (1) jeden komplementarny (np. forward) do sekwencji prawidłowego allelu, (2) drugi (forward) komplementarny do sekwencji zmutowanego allelu, (3) trzeci uniwersalny (reversed). Przeprowadza się dwie reakcje lub rozróżnia się startery 1 i 2 poprzez różne znakowania. W pierwszym przypadku warunki reakcji PCR są tak dobrane by niecałkowicie komplementarny starter nie inicjował reakcji, a tym samym nie dawał produktu, czyli obecność produktu świadczy o genotypie. Rozdział i wizualizację produktów reakcji przeprowadza się w żelu agarozowym (np. z dodatkiem bromku etydyny).

ASO (ang. allele-specific oligonucleotide)-oligonukleotyd specyficzny względem allelu - zsyntetyzowanymy, odpowiednio wyznakowany fragment DNA (sonda) o określonej sekwencji. Fakt, iż komplemetarne dupleksy DNA są bardziej stabilne niż dupleksy o niepełnym dopasowaniu, pomaga wykryć konkretny allel. Sondy mogą być znakowane radioaktywnie, fluorescencyjnie lub chemiluminescencyjnie.

Analiza RFLP (restriction fragment length polymorphism)- analiza długości fragmentów restrykcyjnych - technika analizy DNA (np. produktu reakcji PCR), która pozwala wykryć mutacje występujące w obrębie miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych. Wystarczy pojedyncza zmiana (mutacja, polimorfizm), aby sekwencja wcześniej ctrawiona przez enzym nie została przez niego rozpoznana. Rozdział się i wizualizację produktów takiej reakcji – różniących się długością i ilością fragmentów na które pocięty została odcinek DNA w zależności od sekwencji – przeprowadza się w żelu agarozowym (np. z wykorzystaniem bromku etydyny). Analiza RFLP oprócz zastosowania w diagnostyce molekularnej do sprawdzania obecności konkretnych mutacji związanych z chorobami(w przypadku mukowiscydozy np. mutacji G551D w genie CFTR), jest wykorzystywana w medycynie sądowej, analizach populacyjnych itp.

Osobiste