IEF

Z BioInf

IEF

IEF, czyli izoelektryczne ogniskowanie (skrót z ang. IEF – isoelectric focusing) jest rodzajem elektroforezy, która jest jednocześnie pierwszym etapem elektroforezy dwukierunkowej. Wartość pH buforu w metodzie IEF nie jest stała. Przechodzi ona od najwyższej przy katodzie do wartości najniższej przy anodzie. Liniowy gradient pH tworzą amfoliny (kondensat poliaminy z kwasem akryloaminowym), które mają szeroki zakres środowiska pH, od 3 do 10 (gradient ten cechuje się wysoką stabilnością). W IEF separacja molekuł substancji odbywa się ze względu na jej wartość pI. Wartość ta to takie pH, w którym wypadkowy ładunek makrocząsteczki równy jest 0. Na elektrycznie obojętną substancję nie działają siły pola, zatem pozostaje ona w spoczynku. Jeżeli molekuła znajduje się w środowisku o wyższym pH, w wyniku utraty protonu staje się ujemnie naładowaną molekułą, która będzie się przemieszczać w kierunku dodatniej anody. Odwrotnie gdy molekuła znajdzie się w środowisku o niższym pH.

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja zasady migracji molekuł w analizie IEF (koniec migracji następuje w miejscu gdzie otaczające pH równe jest pI, w każdym innym miejscu w gradiencie białko nabiera ładunku wprawiające je w ruch do punktu pI). (źródło: http://www.nationaldiagnostics.com/images/3_3_1a.gif)

Technika ta charakteryzuje się bardzo wysoką zdolnością rozdzielczą, Różnica wartości pH równa zaledwie 0,02 jest wystarczająca do odseparowania cząsteczek.

Rysunek 2. Aparat do ogniskowania izoelektrycznego ISOGEL firmy Kucharczyk TE®.

Przykładem aparatu wykorzystywanym do izoogniskowania jest ISOGEL firmy Kucharczyk TE. Aparat jest zintegrowany z systemem chołodząco-grzejmym LcooL (Kucharczyk TE ®), który utrzymuje stałą, zadaną temperaturę na płytce podczas całego procesu. Ciepło odprowadzane jest poprzez opływającą spód płytki ciecz. Po przygotowaniu żelu poliakrylamidowego wykonuje się preogniskowanie a w następnie wykonuje się ogniskowanie interesujących nas próbek. Efektem końcowym są precypitaty wytrąconych białek, które po wybarwieniu i zeskanowaniu możemy analizować.

Literatura

  1. http://www.biofizyka.p.lodz.pl/elektroforeza.pdf
  2. http://www.aesociety.org/areas/pdfs/Garfin_IEF_WebArticle9-07.pdf
Osobiste