Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie - technika biologii molekularnej polegająca na odczytywaniu kolejności nukleotydów w cząsteczce DNA.
Historycznie, metoda sekwencjonowania, oparta na syntezie DNA z udziałem polimerazy DNA, została opracowana przez Sanger’a w 1977 roku. W metodzie Sanger’a mieszaninę reakcyjną dzieli się na 4 odrębne probówki a do każdej dodaje inny dNTP – dATP, dTTP, DTP, DTP. Poza dNTP do reakcji dodaje się niewielką ilość dideoksynukleotydów ddNTP –odpowiednio ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP, które są wbudowywane w syntetyzowaną nić DNA. Dołączenie ddNTP uniemożliwia jednak dalsze wydłużanie nici. W ten sposób w powstaje mieszanina fragmentów DNA o różnej długości, zakończonych specyficznym nukleotydem. Mieszaninę produktów rozdziela się następnie elektroforetycznie na żelupoliakrylamidowym i odczytując od dołu rozdziału, ustala sekwencję powstałej nici DNA. Schematyczna ilustracja sekwencjonowania metodą Sanger’a jest przedstawiona na rysunku 1 (źródło: http://www.austincc.edu/mlt/mdfund/mdfund_unit12objectives.html).
Drugą, alternatywną metodą sekwencjonowania DNA jest metoda chemicznej degradacji Maxama-Gilberta. Metoda ta opiera się na wyznakowaniu promieniotwórczym izotopem 5’ końca DNA a następnie degradacji cząsteczki w 4 odrębnych reakcjach z wykorzystaniem 4 mieszanin odczynników. W pierwszym etapie reakcji odbywa się chemiczna modyfikacja zasad azotowych danego nukleotydu. W miejscu pozbawionym zasad nić ulega pęknięciu za zmodyfikowanym nukleotydem. Do modyfikacji G (guanina) stosuje się mieszaninę piperydyny i siarczanu dimetylu, dla par A+G (adenina i guanina) – siarczan dimetylu, piperydynę oraz kwas mrówkowy, dla C (cytozyna) – hydrazynę/chlorek sodu i piperydynę oraz dla C+T (cytozyna i tymina) – hydrazynę i piperydynę. W wyniku reakcji chemicznej powstają fragmenty DNA wyznakowane na 5’ końcu. Ponieważ dana zasada występuje w łańcuchu wiele razy, w probówce otrzymujemy mieszaninę wielu fragmentów o różnej długości. Podobnie jak w metodzie Sanger’a, fragmenty z czterech oddzielnych reakcji rozdziela się elektroforetycznie na żelu i przy pomocy autoradiografii uwidacznia łańcuchy DNA. Uwidocznione prążki odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na 3’ końcu określoną zasadę. Schematyczna ilustracja metody jest przedstawiona na rysunku 2 (źródło: http://biology200.gsu.edu/houghton/8620%20%2711/lecture2.html).
Najpowszechniej obecnie wykorzystywane sekwencjonowanie automatyczne, opiera się na znakowaniu fluorescencyjnym. Każdy z dNTP jest znakowany innym fluorochromem, który ma odmienną falę wzbudzenia. Dzięki temu, iż detektor posiada zdolność rozróżnienia poszczególnych znaczników fluorescencyjnych można przeprowadzić elektroforezę na jednej ścieżce żelu poliakrylamidowego a sekwencja może być odczytywana bezpośrednio w trakcie trwania rozdziału. Wynik jest przedstawiany przez program w postaci 4-kolorowego chromatogramu DNA, gdzie każdy pik reprezentuje zasadę DNA. Przykład wyniku sekwencjonowania ilustruje rysunek 3 (źródło: http://www.dna-sequencing.org/).